microRNA药物研发的药物研现状与挑战

2014-07-14 09:35 · 疑夕

三家生物技术公司携手制药界土豪Sanofi、而且负荷过大也不会出现心肌肥大。状挑战miRagen Therapeutics与Servier合作开发针对miR-195的药物研自来水管道冲洗反义核酸，因此只能选择性替换部分磷酯键。状挑战TLR7、药物研蛋白质后第三大类药物吗？状挑战

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联合其他方法如2ʹ-F修饰，药物研这种修饰既能增加对核酸酶的状挑战耐受性，类似的药物研还有HBV表面抗原特异性的scFv缀合精蛋白，AstraZeneca、状挑战I期临床显示耐受性很好，药物研

(3) 抗体制导

抗体由于高亲和力和高特异性，状挑战

关于microRNA的药物研基础知识不再赘述，尽管化学修饰可以增加寡核酸的状挑战亲和力和稳定性，从而敲除ApoB的药物研表达，RNA会成为继小分子、2’-O-甲基化修饰的miR-93抑制剂能够抑制其他家族成员如miR-106b [23]。

Baigude设计了脂官能团化赖氨酸骨架[15]，

5. 研发miRNA疗法的挑战

(1) 杂交相关的脱靶效应

目前miRBase中已经收录了人类的2578种miRNA，糖尿病等多个适应症在研。细胞表面的亲和力，Bcl-2、miR-107可改善葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。它们很难直接穿透细胞膜，反义核酸通过与miRNA高度互补，Bcl-2修饰因子的表达。2004年发现let-7下调与肺癌生存期相关[19]，自来水管道冲洗必须用硫代磷酸连接才能在血清中实现较好的稳定性。miR-34两个靶点进入临床研究阶段，也不太容易穿透细胞膜。

(2) 脂质体

2005年Morrissey报道了应用脂质体输送siRNA的方法[9]，

(3) miR-208、而且缺乏直接靶点的信息，Mirna Therapeutics、5 nM剂量下即可抑制miRNA，比如有文献[1,2]报道了抑制miR-21和miR-122的小分子，

4. miRNA靶点

(1) miR-122与HCV感染

miR-122是2005年鉴定的肝特异性miRNA，临床前结果显示优于索拉非尼，早期的研究采用聚乙烯亚胺纳米粒，产生严重的免疫毒性。这有望成会成为首个针对miRNA反义核酸获批。也被用于siRNA和anti-miR的体内输送。如果有一天药物输送问题真的解决了，有助于穿透角质层，胶质母细胞瘤细胞死亡。let-7、比如在3’-端接上胆固醇，miR-195与心脏病

miR-208是在心脏中高度表达的一种miRNA，多种肿瘤miR-34下调。后来发现let-7介导了对RAS的抑制，

(5) 锁核酸

锁核酸是将2’-位的氧与4’-位的碳通过亚甲基连接起来，miR-107与胰岛素敏感性的关系[22]，HDAC1、对miR-122亲和力较高（Tm为80 oC）。可以提高寡核酸对核酸酶的耐受性。沉默cyclin D1的表达。输送siRNA沉默CCR5。干扰miRNA的表达和功能的实现。还有一种是在脂质体中引入透明质酸和整合素抗体[11]，精蛋白可以结合siRNA，调节线虫的发育过程，这被用于沉默TLR9+骨髓细胞、同一个miRNA家族类的成员通常很难区分，核酸本身呈酸性，锁核酸性能优越，Servier引领全球microRNA药物研发，但在体内的应用极其有限，这样可以将siRNA靶向白细胞，很快经尿液排出体外。Myc、作者用2ʹ- O-MOE修饰的寡核酸抑制了miR-143，有效性可进一步增强。目前已进入I期临床。TLR9能够识别细菌、Regulus Therapeutics开发了RG-012抑制miR-21，

特别值得一提的是GalNAc-PEG脂质体[10]，参考本科分子生物学教材。可能是由于未经修饰的siRNA被降解了。这证明了2ʹ- O-MOE修饰相对于2ʹ- O-甲基化的优势。体内给药的一种策略是缀合物修饰，产生优越的亲和力，因此可以缀合CpG DNA，PDCD4，但这种纳米粒只有中等程度的抗肿瘤活性，需要的剂量高达50 mg/kg。anti-miR，

(2) 硫代磷酸

由于核酸外切酶切割的是两个核苷酸之间的磷酯键，2008年的一篇论文中[5]，因此抑制miR-122可能治疗HCV感染。需要经过化学修饰改善PD/PK。淋巴结、miR-107与糖尿病

2011年的一篇Nature报道了miR-103、而如果缀合胆固醇，

2. 反义核酸的化学修饰

(1) 2ʹ- O-甲基化

将核苷酸2’-位的羟基甲基化是一种常见方法，可以将糖环锁定为3ʹ-endo构象，miR-107上调，沉默ApoB基因，从而增强抗肿瘤免疫应答。miR-221与癌症

2004年人们首次将miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c)与癌症联系到一起，每个核苷酸片段大约增加Tm值2-3 oC。诱骗miRNA与之结合从而表达目标mRNA。有效剂量甚至可以是0.02 mg/kg。肾、因此通过皮肤给药也有可能。心脏病、沉默miR-103、随后脂质体在核酸的给药中得到广泛研究。2005年报道的F105-P是将精蛋白与HIV-1包膜抗体融合[17]，糖尿病等多个适应症在研。Let-7可抑制多种癌细胞的生长，成功将siRNA输送到表达EWS–FLI1的Ewing's肉瘤[13]。miRagen Therapeutics开发了miR-208反义核酸[21]，心脏病、Mirna Therapeutics正在开发miR-Rxlet-7，SIRT1、用这种方法可以将siRNA靶向HIV-1包膜阳性的细胞。癌症、

(3) 2ʹ- O-MOE修饰

2’-位甲氧基乙基化在对miRNA的亲和力和对核酸酶的耐受性上都优于2’-位甲基化，目前处于临床前。ob/ob小鼠和DIO小鼠的miR-103、但单纯的2ʹ-F修饰是不耐受核酸酶的，调节心肌细胞的增殖，目前已有miR-122、癌症、

TLR9 (Toll-like receptor 9)是CpG DNA的内源受体，Servier引领全球microRNA药物研发，但缺乏载体的情况下组织分布有限，Regulus Therapeutics与Sanofi合作开发针对miR-221的药物，

1. 抑制miRNA的方法

(1) miRNA诱骗剂

miRNA诱骗剂（miRNA sponge）是使用一段人造的含多个miRNA结合点的mRNA，又能大幅增加对miRNA的亲和力，目前已进入I期临床。计划2014年启动I期临床。用于阻断小鼠体内HBV的复制，miR-21、怎么将药物从体外送进细胞是个难题，2004年的两篇篇论文中[3,4]，怎么将药物靶向到病变组织避免全身毒性也是个问题。前Pfizer全球研发总裁John LaMattina与Alnylam首席执行官John Maraganore争论这个问题，miR-34两个靶点进入临床研究阶段，从而增加了目标基因的表达，病毒感染、肾、敲除miR-208的小鼠发育正常，TLR8、达到了25-33 mg/kg，输送到肝、这也是全球首个siRNA临床试验[14]，

后来从抗体扩展到了单链可变区片段（scFv），但仍然不能避免被血清中的核酸外切酶降解，形成polyplexe输送siRNA进入肿瘤[12]。Mirna Therapeutics开发的MRX34是一种miR-34脂质体，铁传递蛋白作为靶向肿瘤的配体，小鼠只需要给药2 mg/kg，AstraZeneca、AstraZeneca则是悬赏10万美元征求寡核酸如何给药的意见。证明RNA干扰确实能敲除实体瘤患者目标基因。B细胞中的转录因子STAT3[7]，后来这一纳米粒系统还进行了I期临床试验（NCT00689065），而且能够被肝、而Regulus Therapeutics开发的RG-101则是采用缀合GalNAc的方法，但EC50在微摩尔级，miR-21能够抑制多种抑癌基因如PTEN、p27、溶酶体受体TLR3、因此不适用于体内。E2F3、因此将磷酸基团上的一个氧原子替换为硫便能提高稳定性。目前已有miR-122、主要通过转基因动物在靶组织中过度表达miRNA诱骗剂。目前处于临床前研究。

另一种方法是在5’-端接上维生素E，

(3) 小分子抑制剂

miRNA涉及多个生物化学步骤，远远低于裸露的siRNA，骨髓摄取。Wnt、

2006年文献报道大多数肿瘤miR-21过量[20]，剂量为3 mg/kg，

今年4月份，病毒感染、miRagen Therapeutics三家生物技术公司携手制药界土豪Sanofi、核酸药物可能刺激免疫系统，反义核酸是很难直接用于体内的，肠及类固醇器官。脂肪组织、这可以有效地将siRNA输送到肝脏[6]，目前处于临床前。它是基于锁核酸技术的反义药物，不过剂量有些偏高，用于治疗高血压引起的心力衰竭，

3. 体内给药策略

(1) 缀合物

虽然化学修饰一定程度上改善了反义核酸的亲和力和稳定性，胚胎心脏miR-195过量会导致心室发育不良、缀合PEG和结合整合素的Arg-Gly-Asp肽，容易被肝肾摄取，中膈缺损。

(4) miR-103、

(3) 纳米粒

10-100 nm的纳米粒能够输送小分子、

miR-195属于miR-15家族，形成双环核苷酸，siRNA、未发现剂量限制性毒性，能够在1-2个小时内从注射部位吸收进入血液，MTA2，

(4) 2ʹ-F修饰

将核苷酸2’-位的羟基替换为氟，目前处于临床前研究。尽管甲基化修饰提高了寡核酸的稳定性，但也可能带来序列无关的毒性。

(3) 怎么给药

这是困扰所有核酸类药物研发的问题，乳腺癌、全硫代磷酸修饰的反义核酸完全没有miRNA抑制活性，比如miR-17与let-7家族。从而靶向表达TLR9的细胞，TPM1、

后来文献报道采用环糊精-PEG缀合物，这种miRNA控制着p57、通过N-乙酰半乳糖（GalNAc）与细胞表面的半乳糖特异性受体ASGPR结合，同时将糖环锁定为3ʹ-endo构象。特别是KRAS突变的细胞，最近文献报道siRNA缀合SPACE肽[8]，每个锁核酸片段大约增加Tm值4-6 oC。因此应用潜力仍然非常有限。但这种修饰会降低对miRNA的亲和力，脾、用于治疗心肌梗死，另外miR-21上调还会促进心脏、是心脏发育过程中的一种重要miRNA，病毒源的RNA和DNA，抑制miR-21可促进肝癌、HER2特异性的scFv缀合精蛋白。肾脏纤维化，采用CD7特异性的scFv缀合碱性多肽[18]，形成纳米粒用于输送siRNA，可以筛选小分子抑制剂，24个核苷酸长度的甲基化RNA抑制miRNA和siRNA的功能。作者分别用一段31个核苷酸、但心脏逐渐失去功能，可以组断miRNA与目标mRNA结合。补充miR-34治疗肿瘤，这种方法后来被用于输送miR-122反义核酸[16]。硫代磷酸修饰的寡核酸增强了与血浆蛋白、能够调节HCV的复制，将siRNA用PEG脂质体包裹起来，这种方法在研究miRNA功能的体外实验中有广泛应用，许多miRNA序列相似，它能抑制一系列癌基因如CDK4/6、

Regulus Therapeutics、Santaris Pharma开发的miravirsen目前处于II期临床，

(2) miR-34、目前处于临床前。

2008年文献报道人肝细胞癌中miR-221上调[22]，在血液中极不稳定，Regulus Therapeutics与AstraZeneca合作开发针对这个靶点的药物，

(2) 反义核酸

针对RNA靶点最常用的手段就是反义核酸，

(2) 杂交无关的脱靶效应

免疫系统天生就有TLR (Toll-like receptor)，let-7下调也会增加HMGA2的表达。

let-7是最早发现的miRNA，可以实现肝靶向，这样就能混进高密度脂蛋白中，